Cours 2013 2014 Orsay.pdf


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Programme

Méthodes d’étude des cellules et des tissus
Technique de fractionnement tissulaire et cellulaire et de culture cellulaire (B.
Baudin)
• Isolement et séparation des cellules : dissociation mécanique, enzymatique, séparation
par centrifugation, filtration, cytométrie
• Culture des cellules : en suspension, adhérentes, choix des milieux de culture, contrôle
de l’atmosphère et du pH, cultures primaires et secondaires, immortalisation, clones et
lignées cellulaires
• Fractionnement subcellulaire : centrifugation différentielle ou en gradient. Application
à l’isolement d’organites, contrôle morphologique et fonctionnel (marqueurs)
Microscopie optique (rappel sur les lois de l’optique), électronique et
Techniques de marquages cellulaire ou tissulaires (B. Baudin)
• Microscopie optique : en lumière transmise (fond clair, noir, contrastes de phase), à
fluorescence (champ large, microscopie confocale), méthodes de marquage et
d’immunomarquage, préparation de coupes fines
• Microscopie électronique : à transmission, balayage, haut voltage, préparation de
coupes ultrafines, méthodes de contraste, cryofracture et cryodécapage
• Microscopie à force atomique
• Méthodes histochimiques : Préparation des tissus, révélation d’activités enzymatiques
in situ, marquage par des isotopes radioactifs ou par des molécules fluorescentes
(sondes, protéines de fusion GFP)
• Méthodes immuno-cytochimiques : anticorps polyclonaux, monoclonaux, hybrides ;
anticorps entiers ou fragments; purification
• Immunofluorescence : directe ou indirecte ; marquage à l’or colloïdal
• Méthodes immuno-enzymatiques en microscopie optique et électronique
• Sondes d’ADN pour hybridation in situ
Études fonctionnelles sur modèles cellulaire (B. Baudin)
• Notion de modèle cellulaire, cultures organotypiques ; transfection et cellules
immortalisées ; notion de génie génétique…
• Mesure des concentrations intracellulaires en ions : patch-clamp, indicateurs
fluorescents
• Incorporation de précurseurs marqués : pulse et pulse-chase
• Extraction et séparation des biomolécules : méthodes séparatives et de fractionnement
des macromolécules
• Étude des fonctions des macromolécules biologiques : protéines (enzymes,
transporteurs, récepteurs) ; méthodes immunologiques (précipitation, immuno-affinité,
western-blot); expression in vitro, interférence ARN