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Author: Pedro Mauricio

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C. Efeitos da concentração de enzima, temperatura e pH na atividade
enzimática.
1) Numerar 7 tubos, sendo um deles o branco. Adicionar os reagentes seguindo a
tabela 2.
2) Os tubos 1,2 referem-se ao efeito da concentração enzimática; os tubos 3,4
referem-se ao efeito da temperatura e os tubos 5,6 relacionam-se ao efeito do pH.
3) Em um tubo de ensaio separado, levar 1 mL de enzima 1/10 ao banho-maria a
95 ºC durante 5 minutos e colocá-lo de volta no gelo. Este preparado será utilizado no
tubo 3. Após isto, adicionar as soluções aos outros tubos conforme a tabela 2.
4) O tubo 4 deverá permanecer durante todo o tempo no gelo.

5) Depois de colocadas as enzimas nos tubos, agitar suavemente e remover os
tubos: Br, 1, 2, 3 e 5 do gelo e, coloca-los no banho-maria a 37 ºC por 5 minutos, ao
mesmo tempo. Após os 5 minutos, colocar rapidamente os tubos de volta no gelo.

6) Enquanto os tubos ainda estiverem no gelo, adicionar 2 mL de DNS em todos
os tubos.

7) Colocar os tubos no banho-maria a 95 ºC por 10 minutos. Transcorrido o
tempo, levar os tubos em tigela com água corrente e adicionar 16 mL de água destilada
em todos os tubos. Homogeneizar os tubos 4 vezes por inversão total.

8) Ler absorbâncias a 540 nm contra o branco.

9) Calcular a atividade enzimática em Unidades (U) em todos os tubos. Utilizando
a concentração de proteínas totais do extrato não diluído, calcular as atividades
específicas das amostras em U/mg.

D. Cálculo da atividade enzimática (utilizando curva-padrão e fator da última
aula).

O fator da curva padrão de BSA da aula anterior será utilizado neste experimento,
assumindo que o fator de Absorbância x Concentração de proteína total, medido na aula
anterior pelo método do biureto com extrato de levedura não foi alterado. Com este fator
será calculada a concentração de proteínas totais do extrato bruto de levedura ([Proteína]
= Abs. x F), e também será utilizado para calcular a atividade específica da enzima
invertase nos extratos.

1) Utilizando a tabela 4, adicionar 2,5 mL de reagente de biureto e 1,5 mL de água
ao tubo branco. No tubo 1, adicionar 2,5 mL de biureto, 1 mL de extrato de levedura e
0,5 mL de água. Agitar levemente os tubos. Levar ao banho-maria a 37ºC durante 15
minutos. Medir a absorbância a 550nm.


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