Disseration Elektroanalytik und Sensorik Uni Bochum .pdf

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Title: Entwicklung und impedimetrische Untersuchung eines RNA-Assays zur Selektion aktiver Hairpinribozyme
Author: Piekielska, Katarzyne

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Entwicklung und impedimetrische Untersuchung eines 
RNA‐Assays zur Selektion aktiver Hairpinribozyme 
 

 
 

DISSERTATION 
 
zur Erlangung des Grades 
eines Doktors der Naturwissenschaften 
Fakultät für Chemie und Biochemie 
Ruhr‐Universität Bochum 

 
vorgelegt von 

Katarzyna Piekielska 
 
Bochum, November 2010 

Diese Arbeit wurde unter der Leitung von Prof. Dr. Wolfgang Schuhmann in der 
Zeit von August 2007 bis November 2010 am Lehrstuhl für Analytische Chemie 
der Ruhr‐Universität Bochum in der Arbeitsgruppe Elektroanalytik und Sensorik 
angefertigt.  Zusätzlich  erfolgten  Aufenthalte  und  Experimente  in  der 
Arbeitsgruppe  Bioorganische  Chemie  an  der  Ernst‐Moritz‐Arndt‐Universität 
Greifswald  unter  der  Leitung  von  Prof.  Dr.  Sabine  Müller    im  November  und 
Dezember  2007,  im  März  2009  sowie  im  November  und  Dezember  2009.

Eingereicht:

08.11.2010

Erstprüfer:

Prof. Dr. Wolfgang Schuhmann

Zweitprüfer:

Prof. Dr. Sabine Müller

 
 

Danksagung: 
 
Ich  möchte  mich  bei  all  den  Leuten  bedanken,  die  mir  während  meiner  Doktorzeit  geholfen  
haben – nicht nur als Kollegen, sondern auch als Freunde: 
 
Prof.  Dr.  Wolfgang  Schuhmann,  dass  er  an  mich  geglaubt  hat  und  mich  in  seine  Forschungsgruppe 
aufgenommen hat. Für die wissenschaftliche Zeit, die er mir gegeben hat, um meine Kenntnisse zu 
verbessern und zu verbreitern. Ich danke für das Vertrauen, das ich nicht nur in wissenschaftlichen, 
sondern auch in nicht wissenschaftlichen Diskussionen erfahren habe. Danke für die Unterhaltungen, 
die mich stärker gemacht haben und mir erlaubt haben, viele Dinge mit anderen Augen zu sehen. Ich 
könnte noch viel schreiben ‐ deswegen sage ich einfach: Danke schön!!! 
 
Prof.  Dr.  Sabine  Müller  für  die  Wärme,  den  Glauben  an  unser  Projekt  und  an  mich.  Für  die 
wissenschaftliche  Hilfe  und  Diskussionen,  die  wir  nicht  immer  von  Angesicht  zu  Angesicht  führen 
konnten.  Ich  bedanke  mich,  dass  ich  immer  nach  Greifswald  kommen  konnte  und  herzlich 
willkommen war. Ich habe mich auch bei deiner Arbeitsgruppe zu Hause gefühlt. Ich könnte mich für 
so viel Bedanken, dass ich keinen Platz mehr für die Arbeit hätte. Vielen Dank für Alles. 
 
Slawomir  Gwiazda  für  die  gute  Zusammenarbeit,  Diskussionen  und  die  warme,  angenehme 
Atmosphäre,  die  er  im  Labor  verbreitet  hat.  Ich  danke  ihm  für  die  Hilfe  bei  der  sprachlichen  und 
wissenschaftlichen Korrektur dieser Arbeit und seine professionelle und ehrliche Meinung. 
 
Andreas  Kersten  für  die  Hilfe  bei  den  SPR‐Messungen.  Ich  danke  ihm,  dass  er  ‐  auch  als  zu  Beginn 
nichts  funktioniert  hat  ‐  mit  mir  weiter  versucht  hat,  gute  Ergebnisse  zu  bekommen.  Für  die 
Diskussionen und die Zeit, die er mir gegeben hat. 
 
Ich danke Prof. Dr. Christian Herrmann für den Platz in seinem Labor, Dr. Adrian Syguda für die Hilfe 
bei  den  biochemischen  Untersuchungen  mittels  RT‐PCR,  die  wissenschaftliche  Diskussion  und  die 
Zeit. Dr. Diana Constantinescu danke ich für die Zeit, die Sie mir gegeben hat und Unterstützung bei 
der  Durchführung  einiger  Experimente.  Dr.  Irene  Drude  für  die  freundliche  und  hilfreiche  Unter‐
stützung während meiner Zeit als Doktorand. Ich danke für Diskussionsbereitschaft, ihre Zeit und ihre 
Geduld.  Ich  danke  der  Arbeitsgruppe  in  Greifswald  für  die  warmherzige  Aufnahme  und  Hilfe.  Ich 
danke Frau Dr. Bettina Appel für die chemische Synthese der RNA. 
 
Dr. Magdalena Gebala möchte ich für ihre wissenschaftliche Hilfe danken; dass du an mich gedacht 
hast ‐ deswegen konnte ich hier sein. Für die frühere Zeit, die mir viel geholfen hat und in der ich viel 
gelernt  habe.  Ich  danke  Dir  für  diese  Zeit,  die  wir  zusammen  verbracht  haben  –  und  die  immer  in 
meinen Gedanken bleibt. 
 
Ich danke Dr. Thorsten Schilling für seine (meistens ) gute Laune und die wunderbare Atmosphäre. 
Dass er mich immer wieder zum Mit‐Ihm‐Lachen bringen konnte. Insbesondere möchte ich mich für 
die sprachliche Korrektur dieser Arbeit bedanken. 
 
Dr.  Sebastian  Neugebauer  für  die  hervorragende  wissenschaftliche  und  sprachliche  Korrektur  von 
Teilen der vorliegenden Arbeit. Für die Diskussionen und die gute Zusammenarbeit, Michaela Nebel 
für  die  schöne  Zeit  und  die  freundliche  Atmosphäre.  Ich  danke  für  ihre  motivierenden  Worte  und 
insbesondere für die Hilfe bei den sprachlichen Korrekturen dieser Doktorarbeit. Für ihre Objektivität 
und ehrliche Meinung. 
 
 
 

Ich möchte auch Jörg, meinem Deutschlehrer, Dankeschön sagen. Ohne seine Hilfe, Strenge bei der 
Arbeit und seine Freundschaft. Ohne ihn hätte ich diese Arbeit nicht auf Deutsch schreiben können. 
Ich danke dir für unser Deutsch‐Polnisch‐Tandem, die Unterhaltungen und dass du von Anfang an an 
mich geglaubt hast. 
 
Ich danke Andrea für viele Unterhaltungen und wunderbare Abende im Schauspielhaus, meinen bei‐
den  Schreibtischnachbarn  Justus  und  Aleksander  für  die  Begleitung  und  die  Teilnahme  an  meinem 
Arbeitsleben. Frau Bettina Stetzka möchte ich danke sagen für die Hilfe bei allen großen und kleinen 
Anliegen. Ich danke Ihr, dass sie immer gute Laune hat und immer mit hilfreicher Hand zur Stelle war. 
 
Prof. Dr. Michael Bron für die Geduld und die Zeit, die er mir gegeben hat. Für die ruhige, freundliche 
und freundschaftliche  Atmosphäre in seiner Arbeitsgruppe an der Universität Halle. 
 
Allen Mitgliedern der AG Schuhmann für die angenehme und hilfsbereite Arbeitsatmosphäre. Für die  
gute Zusammenarbeit, die Diskussionen und die Freizeit, die wir zusammen verbracht haben. Für die 
Grillabende, Spiele und eine wunderschöne Zeit. Insbesondere Thomas Erichsen für die „Erste Hilfe“ 
in  Sachen  Computer.  Für  seine  guten  Worte  und  freundliche  Art.  Für  seine  Objektivität  und 
Ehrlichkeit, dass er bis ans Ende meiner Arbeit die Geduld nicht verloren hat und die  Hoffnung auf 
eine gemeinsame Tasse Kaffee beim Arbeitsgruppen‐Frühstück nicht aufgegeben hat. 
 
Prof.  Dr.  Nina  Dimcheva  für  ihre  Freundschaft  und  ihre  wissenschaftliche  Hilfe.  Dass  sie  immer  bei 
mir war und ist. 
 
Ich möchte mich bei Dorota und Magda bedanken, dass sie meine Freude sind. Für die Unterstützung 
und die guten Worte. Dass sie immer bei mir sind. 
Dziekuje Dorocie i Magdzie, ze sa moimi przyjaciolmi. Dziekuje za wsparcie i dobre slowa. Za to, ze 
zawsze przy mnie sa. 
„Przyjaciel to ktos, przy kim masz odwage byc soba.“ 
 
Meiner Schwester, meinen Eltern, meinen Großeltern und Sylwester für die Unterstützung und Hilfe, 
wann immer ich sie gebraucht habe. Ohne Sie könnte ich nicht ich sein. 
Mojej  siostrze,  rodzicom,  dziadkom  i  Sylwkowi  za  wsparcie  i  pomoc,  kiedy  jej  potrzebowalam.  Bez 
nich nie moglaby byc tym kim jestem. Dziekuje. 
 
Meinem  Freund  Christian  Kulp  danke  ich  dafür,  dass  er  immer  an  meiner  Seite  gestanden  hat.  Ich 
bedanke mich bei Ihm für sein Verständnis während schlechter Zeiten, lange Arbeitsstunden, dass er 
immer motivierende Worte gefunden hat und immer an mich geglaubt hat. Ich danke ihm für seine 
Freundschaft und Liebe und dass er mir immer den Rücken gestärkt hat. Du hast mir die Kraft und 
den  Glauben  gegeben,  dass  ich  das  hier  schaffen  kann.  Insbesondere  möchte  ich  mich  hier  für 
lebhafte  wissenschaftliche  Diskussionen  während  meiner  Experimente,  aber  auch  während  ich 
geschrieben habe, bedanken. Für die in vielen Stunden vor dem Computer diskutierten sprachlichen 
Korrekturen der vorliegenden Arbeit, die wir dann gemeinsam vorgenommen haben. Du hast mir die 
Glauben gegeben, dass ich auf Deutsch schreiben kann. Ich danke Dir, dass du bist. 
„Chce Ci podziekowac za tyle, tyle rzeczy, ale najbardziej za to, ze jestes.“ 
 
 
 

„Carpe diem!!!“

 
           Horace 
 
 

Inhalt 
LISTE DER MATERIALIEN UND GERÄTE .................................................................................... I 
1.  EINFÜHRUNG .............................................................................................................................. 1 
2.  STAND DER TECHNIK .............................................................................................................. 3 
2.1 

Eigenschaften und Funktionen von RNA .................................................................................... 3 

2.2 

Aufgaben von Ribozymen ................................................................................................................ 8 

2.3 

Das Hairpinribozym ........................................................................................................................ 11 

2.4 

Grundlagen der chemischen Oligonukleotidsynthese ....................................................... 18 

2.5 

Von Untersuchungen mit markierter RNA zu markierungsfreien Technologien .... 24 

2.6 
 

Selbstorganisierende Monolagen als Grundprinzip für den Aufbau von RNA‐Assays
29 

2.7 

Motivation und Ziel dieser Arbeit .............................................................................................. 33 

3.  EIGENE ARBEITEN UND DISKUSSION .............................................................................. 35 
3.1 

Vorüberlegungen zu dieser Arbeit ............................................................................................ 35 

3.2 

Überprüfung der Spaltungsreaktion mittels Li‐Cor ............................................................ 39 

3.3 

Impedanzspektroskopische Analyse des RNA‐Assays ....................................................... 44 

3.4 

Impedanzspektroskopische Analyse der Spaltungsreaktion .......................................... 48 

3.5 

Analyse des RNA‐Assays und der Spaltungsreaktion mittels 
Oberflächenplasmonenresonanzspektroskopie .................................................................. 52 

3.6 

Optimierung der Analysemethode ............................................................................................ 60 

3.7 

Getrennte Immobilisierung von RNA‐Substrat und MCH .................................................. 71 

3.8 

Der Einfluss von Ionen auf den Assay ....................................................................................... 80 

3.9 

Analyse der Spaltungsreaktion mittels RT‐PCR, Transkription und 
Gelelektrophorese ........................................................................................................................... 85 

3.10  Untersuchung des selektierten Ribozyms auf Aktivität für die Spaltungsreaktion 95 
 
 

 
 
 
3.11  Zusammenfassung ........................................................................................................................... 97 

4.  GRUNDLAGEN UND EXPERIMENTELLES ...................................................................... 101 
4.1 

Li‐Cor‐Analyse ................................................................................................................................. 101 

4.2 

Reverse Transkription, Polymerase‐Kettenreaktion und in vitro Transkription . 104 

4.3 

Impedanzspektroskopie ............................................................................................................. 112 

4.4 

Oberflächenplasmonenresonanzspektroskopie ................................................................ 124 

4.5 

Arbeitsvorschriften für die verwendete RNA ...................................................................... 129 
4.5.1  Durchführung der RNA‐Synthese ...................................................................................................... 129 
4.5.2  Enzymatische RNA‐Synthese durch Doppelstrangauffüllung ............................................................ 131 
4.5.3  UV/VIS Spektroskopie zur Bestimmung der RNA‐Konzentration ...................................................... 134 
4.5.4  Postsynthetische Markierung ‐ Kopplung mit ATTO‐680 .................................................................. 134 
4.5.5  Oligonukleotidaufreinigung durch Hochleistungsflüssigchromatographie und 
Umkehrphasenchromatograhie ...................................................................................................................... 135 
4.5.6  Oligonukleotidaufreinigung durch denaturierende und native Polyacrylamidgelelektrophorese .... 135 
4.5.7  Oligonukleotidaufreinigung durch Agarose‐Gelelektrophorese ....................................................... 136 
4.5.8  Oligonukleotidaufreinigung durch Gelfiltration ................................................................................ 137 

4.6 
 

Chronocoulometrie ....................................................................................................................... 137 

5.  LITERATUR ............................................................................................................................ 150 
 

6.  ANHANG .................................................................................................................................. 150 
6.1 Oligonukleotidsequenzen ................................................................................................................. 150 


 

Liste der Materialien und Geräte 
Liste der Materialien und Geräte 
 
Labor‐ und Feinchemikalien 
 
Acetonitril                                                                          
40%ige Acrylamid/Bisacrylamid‐Gellösung (19:1)    
40%ige Acrylamid/Bisacrylamid‐Gellösung (19:1)      
ATTO‐680 (N‐Hydroxysuccinimidester)                      
Bausteine für Festphasensynthese                             

J.T.Baker, Niederlande
Roth, Deutschland
National diagnostics, Vereinigte Staaten von Amerika
ATTO – Tech GmbH, Deutschland 
ChemGenes, Vereinigte Staaten von Amerika 

Benzeneethanethiol                                                      
BMT                                                                                  
Borsäure                                                                          
DMF                                                                                  
DNA Primer   (allgemein)                                             
dNTP‐Set (je 100 mmol/l)                                                 
DTT (Dithiothreitol)                                                      
EDTA                                                                                 
Ethanol                                                                               
FMN                                                                                    
Harnstoff                                                                        
Kaliumchlorid                                                               
Kaliumhexacyanoferrat (III)                                        
Kaliumhexacyanoferrat (II)‐3‐hydrat                        
Lithiumperchlorat                                                            
Magnesiumsulfat                                                              
Magnesiumchlorid                                                     
Natriumsulfat                                                                     
6‐Mercapto‐1‐hexanol                                              
NTP‐Set (je 100 mmol/l)                                                    
Polierfilz                                                                             
Polierpasten auf Aluminiumoxidbasis  
(0,05 µm, 0,3 µm und 1,0 µm)                           
Rutheniumhexaminchlorid                                              
Schwefelsäure 
Sephadex G25 Fine                                                           
Silbernitrat                                                                    
N,N,N',N'‐Tetramethylethylenediamine (TEMED) 
Tris                                                                                    

Sigma Aldrich, Deutschland
emp biotch GmbH, Deutschland 
J.T.Baker, Niederlande
VWR Prolabo, Deutschland 
Purimex, Deutschland
Fermentas, Deutschland
Sigma Aldrich, Deutschland
Merck, Deutschland
J.T. Baker, Niederlande
Sigma Aldrich, Deutschland
Biomol, Deutschland
VWR Prolabo, Deutschland
Riedel‐de Haen, Deutschland
Riedel‐de‐Haen, Deutschland
Sigma, Deutschland
J.T. Baker, Niederlande
J.T.Baker, Niederlande
J.T. Baker, Niederlande
Aldrich/Fluka, Deutschland
Fermentas, Deutschland
LECO, Mönchengladbach, Deutschland 
LECO, Mönchengladbach, Deutschland 
ABCR, Deutschland
J.T. Baker, Niederlande
GE Healthcare, 
Aldrich, Deutschland
Sigma, Deutschland
Biomol, Deutschland

 
 
 

 


 

Liste der Materialien und Geräte 
Enzyme 
 
DNase I                                                                       Fermentas, Deutschland
DNA‐Polymerase (Klenow Fragment exo‐)              Fermentas, Deutschland
Taq DNA‐Polymerase                                                  New England BioLabs, Vereinigte Staaten 
von Amerika 
T7‐RNA‐Polymerase                                                    Fermentas, Deutschland
SuperScript III Reverse Transcriptase                       Invitrogen, Vereinigte Staaten von Amerika 
 
Puffer und Lösungen 

 
AMA:                                                                                                                                                                       
25% wässriger Ammoniak/8 mol/l ethanolisches   
Methylamin 1:1 
4%ige agarose Gelelektrophorese‐
                                                                                                   
Gelösung:         
4 Vol% Agarose, 1xTBA 
 
Carbonatpuffer:            
0,1 mol/l Na2CO3, pH = 8.5
Denaturiererender Austragspuffer:                                                                                                                   
98 Vol% Formamid, 2 Vol% 0.5 M EDTA 
15%ige denaturierende PAA – Gellösung:                                                                                                        
15 Vol% Acrylamid/Bisacrylamid (19:1), 1x TBE, 7M 
Harnstoff 
Für quantitative Fragmentanalyse:               
 
                                                                              0,6xTBE, 7 mol/l Harnstoff
 
15 Vol% Acrylamid/Bisacrylamid (19:1) 
fluoreszenzrein, 
20%ige denaturierende PAA – Gellösung:                                                                                                        
20 Vol% Acrylamid/Bisacrylamid (19:1), 1x TBE, 
7 mol/l Harnstoff 
DNA‐Leiter, Ultra Low Range                           Fermentas, Deutschland
 
Lösungen für Extraktion:                                  1. Phenol / 1xTE ges., 2. Chloroform/Isoamylalkohol   
(24:1), 3. Diethylether 
12% Gellösung für Fragmentanalyse:             12 Vol% Acrylamid/Bisacrylamid (19:1),0.6 x TBE, 7M Harnstoff 
 
Klenow – Puffer (10x)                                        Fermentas, Deutschland
 
Lösung für CC‐Messung:                          
100 µmol/l [Ru(NH3)6]Cl3 in 10 mmol/l Tris‐HCl, 
pH=7,4 
Lösung für die EIS‐Messungen:           
äquimolare Konzentrationen der K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6] in  
0.1 mol/l KCl und in 0,1 mol/l Tris‐HCl, pH= 7,2 
                                                                              1. 3 mol/l NaOAc, pH=5.2
 
Lösungen für Elution:                                       
 
                                                                              2. 100 mmol/l MgCl2
                                                                              3. Ethanol
 
Lösungen für Festphasensynthese:                                                                                                             
Oxidationslösung (0.01 mol/l I2 in 2,4,6‐  
                                                                              Collidin/Wasser/ Acetonitril (1:5:11; v/v))
 
                                                                              Cap A (N – Methylimidazol / Acetonitril 
(1:5; v/v))
(2:3:5; v/v))
                                                                              Cap B (Ac2O/2,4,6 – Collin/Acetonitril 
 
                                                                              3% Dichloressigsäure in 1,2 –Dichlorethan 
Detritylierungsreagenz 
Aktivator 
0.25 mol/l BMT in Acetonitril
 
Lithiumelutionspuffer                                                                                                                                    

II 
 

Liste der Materialien und Geräte 
2 mol/l Lithiumperchlorat
TM

6X MassRuler  DNA Loading Dye:                 Fermentas, Deutschland
Nativer Auftragspuffer:                                     50 Vol % 1xTBE, 50 V % Glycerin 

 
 

15%ige  native PAA – Gellösung                      15 Vol% Acrylamid/Bisacrylamid (19:1), 1xTBE Puffer 
20%ige  native PAA – Gellösung                      20 Vol% Acrylamid/Bisacrylamid (19:1), 1xTBE Puffer   
6X Orange Loading Dye Solution                     Fermentas, Deutschland
 
Färbepuffer:  
 
Ethidiumbromid (EtB) 
Invitrogen, Vereinigte Staaten von Amerika 
 
GelStar                                                                 Cambrex,  Vereinigte Staaten von Amerika  
 
SYBR Green I                                                       Invitrogen, Vereinigte Staaten von Amerika 
 
Stop‐ Mix                  
7 M Harnstoff, 50 mmol/l EDTA
 
1xTAE                                    
40 mmol/l Tris, 40 mmol/l Acetat, 1 mmol/l EDTA, pH= 8,5 
1xTBE                                                                0.1 mol/l Tris, 85 mmol/l Borsäure, 1 mmol/l EDTA, pH = 8,3              
TEAAc – Puffer                                                    0.1 mol/l Triethylammoniumacetat, pH = 6.5 und 7.0                           
ThermoPolPuffer                                               New England Biolabs, Vereinigte Staaten von 
 
Amerika 
Transkriptionspuffer, HEPES (5x)                    Fermentas, Deutschland
 
Tris‐HCl Puffer                                                    10 mol/l und 100 mol/l wässerige Lösungen 
 
 
Geräte und Software 

 
Analysewaagen:                                                               
Elektroden                                                                   

METTLER TOLEDO, Deutschland 
CH Instruments, Vereinigte Staaten von Amerika 

Gelelektophorese: 
MIDGET 2050 Elektrophoresesystem                      
Mighty Small II                                                
Heizblock UBS‐2 

Pharmacia, Deutschland
SERVA Electrophoresis, Deutschland 
Grant, Vereinigtes Königreich Großbritannien 

HPLC: 
Äkta Purifier                                                                         Amersham Biosciences, Deutschland 
Säulenofen HPLC column Chiller/Heater                         Echo Therm, Deutschland
Elektrophoresekammern für Agarosegele                       Roth, Deutschland
Spektrophotometer: 
Nanodrop                                                                      
Thermo Scientific, Deutschland
Lyophyllisation: 
Alpha 1‐2                                                                                Christ, Deutschland
Univapo 100H                                                                     UniEquip, Deutschland
Speed‐Vac SC 110                                                      
Savant, Vereinigte Staaten von Amerika 
pH Meter                                                                                WTW, Deutschland
Pipetten                                                                                  Eppendorf, Deutschland
PCR‐Gerät: 
Mastercycler Gradient                                                 

Eppendorf, Deutschland

III 
 


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