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Entwicklung und impedimetrische Untersuchung eines
RNA‐Assays zur Selektion aktiver Hairpinribozyme
DISSERTATION
zur Erlangung des Grades
eines Doktors der Naturwissenschaften
Fakultät für Chemie und Biochemie
Ruhr‐Universität Bochum
vorgelegt von
Katarzyna Piekielska
Bochum, November 2010
Diese Arbeit wurde unter der Leitung von Prof. Dr. Wolfgang Schuhmann in der
Zeit von August 2007 bis November 2010 am Lehrstuhl für Analytische Chemie
der Ruhr‐Universität Bochum in der Arbeitsgruppe Elektroanalytik und Sensorik
angefertigt. Zusätzlich erfolgten Aufenthalte und Experimente in der
Arbeitsgruppe Bioorganische Chemie an der Ernst‐Moritz‐Arndt‐Universität
Greifswald unter der Leitung von Prof. Dr. Sabine Müller im November und
Dezember 2007, im März 2009 sowie im November und Dezember 2009.
Eingereicht:
08.11.2010
Erstprüfer:
Prof. Dr. Wolfgang Schuhmann
Zweitprüfer:
Prof. Dr. Sabine Müller
Danksagung:
Ich möchte mich bei all den Leuten bedanken, die mir während meiner Doktorzeit geholfen
haben – nicht nur als Kollegen, sondern auch als Freunde:
Prof. Dr. Wolfgang Schuhmann, dass er an mich geglaubt hat und mich in seine Forschungsgruppe
aufgenommen hat. Für die wissenschaftliche Zeit, die er mir gegeben hat, um meine Kenntnisse zu
verbessern und zu verbreitern. Ich danke für das Vertrauen, das ich nicht nur in wissenschaftlichen,
sondern auch in nicht wissenschaftlichen Diskussionen erfahren habe. Danke für die Unterhaltungen,
die mich stärker gemacht haben und mir erlaubt haben, viele Dinge mit anderen Augen zu sehen. Ich
könnte noch viel schreiben ‐ deswegen sage ich einfach: Danke schön!!!
Prof. Dr. Sabine Müller für die Wärme, den Glauben an unser Projekt und an mich. Für die
wissenschaftliche Hilfe und Diskussionen, die wir nicht immer von Angesicht zu Angesicht führen
konnten. Ich bedanke mich, dass ich immer nach Greifswald kommen konnte und herzlich
willkommen war. Ich habe mich auch bei deiner Arbeitsgruppe zu Hause gefühlt. Ich könnte mich für
so viel Bedanken, dass ich keinen Platz mehr für die Arbeit hätte. Vielen Dank für Alles.
Slawomir Gwiazda für die gute Zusammenarbeit, Diskussionen und die warme, angenehme
Atmosphäre, die er im Labor verbreitet hat. Ich danke ihm für die Hilfe bei der sprachlichen und
wissenschaftlichen Korrektur dieser Arbeit und seine professionelle und ehrliche Meinung.
Andreas Kersten für die Hilfe bei den SPR‐Messungen. Ich danke ihm, dass er ‐ auch als zu Beginn
nichts funktioniert hat ‐ mit mir weiter versucht hat, gute Ergebnisse zu bekommen. Für die
Diskussionen und die Zeit, die er mir gegeben hat.
Ich danke Prof. Dr. Christian Herrmann für den Platz in seinem Labor, Dr. Adrian Syguda für die Hilfe
bei den biochemischen Untersuchungen mittels RT‐PCR, die wissenschaftliche Diskussion und die
Zeit. Dr. Diana Constantinescu danke ich für die Zeit, die Sie mir gegeben hat und Unterstützung bei
der Durchführung einiger Experimente. Dr. Irene Drude für die freundliche und hilfreiche Unter‐
stützung während meiner Zeit als Doktorand. Ich danke für Diskussionsbereitschaft, ihre Zeit und ihre
Geduld. Ich danke der Arbeitsgruppe in Greifswald für die warmherzige Aufnahme und Hilfe. Ich
danke Frau Dr. Bettina Appel für die chemische Synthese der RNA.
Dr. Magdalena Gebala möchte ich für ihre wissenschaftliche Hilfe danken; dass du an mich gedacht
hast ‐ deswegen konnte ich hier sein. Für die frühere Zeit, die mir viel geholfen hat und in der ich viel
gelernt habe. Ich danke Dir für diese Zeit, die wir zusammen verbracht haben – und die immer in
meinen Gedanken bleibt.
Ich danke Dr. Thorsten Schilling für seine (meistens ) gute Laune und die wunderbare Atmosphäre.
Dass er mich immer wieder zum Mit‐Ihm‐Lachen bringen konnte. Insbesondere möchte ich mich für
die sprachliche Korrektur dieser Arbeit bedanken.
Dr. Sebastian Neugebauer für die hervorragende wissenschaftliche und sprachliche Korrektur von
Teilen der vorliegenden Arbeit. Für die Diskussionen und die gute Zusammenarbeit, Michaela Nebel
für die schöne Zeit und die freundliche Atmosphäre. Ich danke für ihre motivierenden Worte und
insbesondere für die Hilfe bei den sprachlichen Korrekturen dieser Doktorarbeit. Für ihre Objektivität
und ehrliche Meinung.
Ich möchte auch Jörg, meinem Deutschlehrer, Dankeschön sagen. Ohne seine Hilfe, Strenge bei der
Arbeit und seine Freundschaft. Ohne ihn hätte ich diese Arbeit nicht auf Deutsch schreiben können.
Ich danke dir für unser Deutsch‐Polnisch‐Tandem, die Unterhaltungen und dass du von Anfang an an
mich geglaubt hast.
Ich danke Andrea für viele Unterhaltungen und wunderbare Abende im Schauspielhaus, meinen bei‐
den Schreibtischnachbarn Justus und Aleksander für die Begleitung und die Teilnahme an meinem
Arbeitsleben. Frau Bettina Stetzka möchte ich danke sagen für die Hilfe bei allen großen und kleinen
Anliegen. Ich danke Ihr, dass sie immer gute Laune hat und immer mit hilfreicher Hand zur Stelle war.
Prof. Dr. Michael Bron für die Geduld und die Zeit, die er mir gegeben hat. Für die ruhige, freundliche
und freundschaftliche Atmosphäre in seiner Arbeitsgruppe an der Universität Halle.
Allen Mitgliedern der AG Schuhmann für die angenehme und hilfsbereite Arbeitsatmosphäre. Für die
gute Zusammenarbeit, die Diskussionen und die Freizeit, die wir zusammen verbracht haben. Für die
Grillabende, Spiele und eine wunderschöne Zeit. Insbesondere Thomas Erichsen für die „Erste Hilfe“
in Sachen Computer. Für seine guten Worte und freundliche Art. Für seine Objektivität und
Ehrlichkeit, dass er bis ans Ende meiner Arbeit die Geduld nicht verloren hat und die Hoffnung auf
eine gemeinsame Tasse Kaffee beim Arbeitsgruppen‐Frühstück nicht aufgegeben hat.
Prof. Dr. Nina Dimcheva für ihre Freundschaft und ihre wissenschaftliche Hilfe. Dass sie immer bei
mir war und ist.
Ich möchte mich bei Dorota und Magda bedanken, dass sie meine Freude sind. Für die Unterstützung
und die guten Worte. Dass sie immer bei mir sind.
Dziekuje Dorocie i Magdzie, ze sa moimi przyjaciolmi. Dziekuje za wsparcie i dobre slowa. Za to, ze
zawsze przy mnie sa.
„Przyjaciel to ktos, przy kim masz odwage byc soba.“
Meiner Schwester, meinen Eltern, meinen Großeltern und Sylwester für die Unterstützung und Hilfe,
wann immer ich sie gebraucht habe. Ohne Sie könnte ich nicht ich sein.
Mojej siostrze, rodzicom, dziadkom i Sylwkowi za wsparcie i pomoc, kiedy jej potrzebowalam. Bez
nich nie moglaby byc tym kim jestem. Dziekuje.
Meinem Freund Christian Kulp danke ich dafür, dass er immer an meiner Seite gestanden hat. Ich
bedanke mich bei Ihm für sein Verständnis während schlechter Zeiten, lange Arbeitsstunden, dass er
immer motivierende Worte gefunden hat und immer an mich geglaubt hat. Ich danke ihm für seine
Freundschaft und Liebe und dass er mir immer den Rücken gestärkt hat. Du hast mir die Kraft und
den Glauben gegeben, dass ich das hier schaffen kann. Insbesondere möchte ich mich hier für
lebhafte wissenschaftliche Diskussionen während meiner Experimente, aber auch während ich
geschrieben habe, bedanken. Für die in vielen Stunden vor dem Computer diskutierten sprachlichen
Korrekturen der vorliegenden Arbeit, die wir dann gemeinsam vorgenommen haben. Du hast mir die
Glauben gegeben, dass ich auf Deutsch schreiben kann. Ich danke Dir, dass du bist.
„Chce Ci podziekowac za tyle, tyle rzeczy, ale najbardziej za to, ze jestes.“
„Carpe diem!!!“
Horace
Inhalt
LISTE DER MATERIALIEN UND GERÄTE .................................................................................... I
1. EINFÜHRUNG .............................................................................................................................. 1
2. STAND DER TECHNIK .............................................................................................................. 3
2.1
Eigenschaften und Funktionen von RNA .................................................................................... 3
2.2
Aufgaben von Ribozymen ................................................................................................................ 8
2.3
Das Hairpinribozym ........................................................................................................................ 11
2.4
Grundlagen der chemischen Oligonukleotidsynthese ....................................................... 18
2.5
Von Untersuchungen mit markierter RNA zu markierungsfreien Technologien .... 24
2.6
Selbstorganisierende Monolagen als Grundprinzip für den Aufbau von RNA‐Assays
29
2.7
Motivation und Ziel dieser Arbeit .............................................................................................. 33
3. EIGENE ARBEITEN UND DISKUSSION .............................................................................. 35
3.1
Vorüberlegungen zu dieser Arbeit ............................................................................................ 35
3.2
Überprüfung der Spaltungsreaktion mittels Li‐Cor ............................................................ 39
3.3
Impedanzspektroskopische Analyse des RNA‐Assays ....................................................... 44
3.4
Impedanzspektroskopische Analyse der Spaltungsreaktion .......................................... 48
3.5
Analyse des RNA‐Assays und der Spaltungsreaktion mittels
Oberflächenplasmonenresonanzspektroskopie .................................................................. 52
3.6
Optimierung der Analysemethode ............................................................................................ 60
3.7
Getrennte Immobilisierung von RNA‐Substrat und MCH .................................................. 71
3.8
Der Einfluss von Ionen auf den Assay ....................................................................................... 80
3.9
Analyse der Spaltungsreaktion mittels RT‐PCR, Transkription und
Gelelektrophorese ........................................................................................................................... 85
3.10 Untersuchung des selektierten Ribozyms auf Aktivität für die Spaltungsreaktion 95
3.11 Zusammenfassung ........................................................................................................................... 97
4. GRUNDLAGEN UND EXPERIMENTELLES ...................................................................... 101
4.1
Li‐Cor‐Analyse ................................................................................................................................. 101
4.2
Reverse Transkription, Polymerase‐Kettenreaktion und in vitro Transkription . 104
4.3
Impedanzspektroskopie ............................................................................................................. 112
4.4
Oberflächenplasmonenresonanzspektroskopie ................................................................ 124
4.5
Arbeitsvorschriften für die verwendete RNA ...................................................................... 129
4.5.1 Durchführung der RNA‐Synthese ...................................................................................................... 129
4.5.2 Enzymatische RNA‐Synthese durch Doppelstrangauffüllung ............................................................ 131
4.5.3 UV/VIS Spektroskopie zur Bestimmung der RNA‐Konzentration ...................................................... 134
4.5.4 Postsynthetische Markierung ‐ Kopplung mit ATTO‐680 .................................................................. 134
4.5.5 Oligonukleotidaufreinigung durch Hochleistungsflüssigchromatographie und
Umkehrphasenchromatograhie ...................................................................................................................... 135
4.5.6 Oligonukleotidaufreinigung durch denaturierende und native Polyacrylamidgelelektrophorese .... 135
4.5.7 Oligonukleotidaufreinigung durch Agarose‐Gelelektrophorese ....................................................... 136
4.5.8 Oligonukleotidaufreinigung durch Gelfiltration ................................................................................ 137
4.6
Chronocoulometrie ....................................................................................................................... 137
5. LITERATUR ............................................................................................................................ 150
6. ANHANG .................................................................................................................................. 150
6.1 Oligonukleotidsequenzen ................................................................................................................. 150
2
Liste der Materialien und Geräte
Liste der Materialien und Geräte
Labor‐ und Feinchemikalien
Acetonitril
40%ige Acrylamid/Bisacrylamid‐Gellösung (19:1)
40%ige Acrylamid/Bisacrylamid‐Gellösung (19:1)
ATTO‐680 (N‐Hydroxysuccinimidester)
Bausteine für Festphasensynthese
J.T.Baker, Niederlande
Roth, Deutschland
National diagnostics, Vereinigte Staaten von Amerika
ATTO – Tech GmbH, Deutschland
ChemGenes, Vereinigte Staaten von Amerika
Benzeneethanethiol
BMT
Borsäure
DMF
DNA Primer (allgemein)
dNTP‐Set (je 100 mmol/l)
DTT (Dithiothreitol)
EDTA
Ethanol
FMN
Harnstoff
Kaliumchlorid
Kaliumhexacyanoferrat (III)
Kaliumhexacyanoferrat (II)‐3‐hydrat
Lithiumperchlorat
Magnesiumsulfat
Magnesiumchlorid
Natriumsulfat
6‐Mercapto‐1‐hexanol
NTP‐Set (je 100 mmol/l)
Polierfilz
Polierpasten auf Aluminiumoxidbasis
(0,05 µm, 0,3 µm und 1,0 µm)
Rutheniumhexaminchlorid
Schwefelsäure
Sephadex G25 Fine
Silbernitrat
N,N,N',N'‐Tetramethylethylenediamine (TEMED)
Tris
Sigma Aldrich, Deutschland
emp biotch GmbH, Deutschland
J.T.Baker, Niederlande
VWR Prolabo, Deutschland
Purimex, Deutschland
Fermentas, Deutschland
Sigma Aldrich, Deutschland
Merck, Deutschland
J.T. Baker, Niederlande
Sigma Aldrich, Deutschland
Biomol, Deutschland
VWR Prolabo, Deutschland
Riedel‐de Haen, Deutschland
Riedel‐de‐Haen, Deutschland
Sigma, Deutschland
J.T. Baker, Niederlande
J.T.Baker, Niederlande
J.T. Baker, Niederlande
Aldrich/Fluka, Deutschland
Fermentas, Deutschland
LECO, Mönchengladbach, Deutschland
LECO, Mönchengladbach, Deutschland
ABCR, Deutschland
J.T. Baker, Niederlande
GE Healthcare,
Aldrich, Deutschland
Sigma, Deutschland
Biomol, Deutschland
I
Liste der Materialien und Geräte
Enzyme
DNase I Fermentas, Deutschland
DNA‐Polymerase (Klenow Fragment exo‐) Fermentas, Deutschland
Taq DNA‐Polymerase New England BioLabs, Vereinigte Staaten
von Amerika
T7‐RNA‐Polymerase Fermentas, Deutschland
SuperScript III Reverse Transcriptase Invitrogen, Vereinigte Staaten von Amerika
Puffer und Lösungen
AMA:
25% wässriger Ammoniak/8 mol/l ethanolisches
Methylamin 1:1
4%ige agarose Gelelektrophorese‐
Gelösung:
4 Vol% Agarose, 1xTBA
Carbonatpuffer:
0,1 mol/l Na2CO3, pH = 8.5
Denaturiererender Austragspuffer:
98 Vol% Formamid, 2 Vol% 0.5 M EDTA
15%ige denaturierende PAA – Gellösung:
15 Vol% Acrylamid/Bisacrylamid (19:1), 1x TBE, 7M
Harnstoff
Für quantitative Fragmentanalyse:
0,6xTBE, 7 mol/l Harnstoff
15 Vol% Acrylamid/Bisacrylamid (19:1)
fluoreszenzrein,
20%ige denaturierende PAA – Gellösung:
20 Vol% Acrylamid/Bisacrylamid (19:1), 1x TBE,
7 mol/l Harnstoff
DNA‐Leiter, Ultra Low Range Fermentas, Deutschland
Lösungen für Extraktion: 1. Phenol / 1xTE ges., 2. Chloroform/Isoamylalkohol
(24:1), 3. Diethylether
12% Gellösung für Fragmentanalyse: 12 Vol% Acrylamid/Bisacrylamid (19:1),0.6 x TBE, 7M Harnstoff
Klenow – Puffer (10x) Fermentas, Deutschland
Lösung für CC‐Messung:
100 µmol/l [Ru(NH3)6]Cl3 in 10 mmol/l Tris‐HCl,
pH=7,4
Lösung für die EIS‐Messungen:
äquimolare Konzentrationen der K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6] in
0.1 mol/l KCl und in 0,1 mol/l Tris‐HCl, pH= 7,2
1. 3 mol/l NaOAc, pH=5.2
Lösungen für Elution:
2. 100 mmol/l MgCl2
3. Ethanol
Lösungen für Festphasensynthese:
Oxidationslösung (0.01 mol/l I2 in 2,4,6‐
Collidin/Wasser/ Acetonitril (1:5:11; v/v))
Cap A (N – Methylimidazol / Acetonitril
(1:5; v/v))
(2:3:5; v/v))
Cap B (Ac2O/2,4,6 – Collin/Acetonitril
3% Dichloressigsäure in 1,2 –Dichlorethan
Detritylierungsreagenz
Aktivator
0.25 mol/l BMT in Acetonitril
Lithiumelutionspuffer
II
Liste der Materialien und Geräte
2 mol/l Lithiumperchlorat
TM
6X MassRuler DNA Loading Dye: Fermentas, Deutschland
Nativer Auftragspuffer: 50 Vol % 1xTBE, 50 V % Glycerin
15%ige native PAA – Gellösung 15 Vol% Acrylamid/Bisacrylamid (19:1), 1xTBE Puffer
20%ige native PAA – Gellösung 20 Vol% Acrylamid/Bisacrylamid (19:1), 1xTBE Puffer
6X Orange Loading Dye Solution Fermentas, Deutschland
Färbepuffer:
Ethidiumbromid (EtB)
Invitrogen, Vereinigte Staaten von Amerika
GelStar Cambrex, Vereinigte Staaten von Amerika
SYBR Green I Invitrogen, Vereinigte Staaten von Amerika
Stop‐ Mix
7 M Harnstoff, 50 mmol/l EDTA
1xTAE
40 mmol/l Tris, 40 mmol/l Acetat, 1 mmol/l EDTA, pH= 8,5
1xTBE 0.1 mol/l Tris, 85 mmol/l Borsäure, 1 mmol/l EDTA, pH = 8,3
TEAAc – Puffer 0.1 mol/l Triethylammoniumacetat, pH = 6.5 und 7.0
ThermoPolPuffer New England Biolabs, Vereinigte Staaten von
Amerika
Transkriptionspuffer, HEPES (5x) Fermentas, Deutschland
Tris‐HCl Puffer 10 mol/l und 100 mol/l wässerige Lösungen
Geräte und Software
Analysewaagen:
Elektroden
METTLER TOLEDO, Deutschland
CH Instruments, Vereinigte Staaten von Amerika
Gelelektophorese:
MIDGET 2050 Elektrophoresesystem
Mighty Small II
Heizblock UBS‐2
Pharmacia, Deutschland
SERVA Electrophoresis, Deutschland
Grant, Vereinigtes Königreich Großbritannien
HPLC:
Äkta Purifier Amersham Biosciences, Deutschland
Säulenofen HPLC column Chiller/Heater Echo Therm, Deutschland
Elektrophoresekammern für Agarosegele Roth, Deutschland
Spektrophotometer:
Nanodrop
Thermo Scientific, Deutschland
Lyophyllisation:
Alpha 1‐2 Christ, Deutschland
Univapo 100H UniEquip, Deutschland
Speed‐Vac SC 110
Savant, Vereinigte Staaten von Amerika
pH Meter WTW, Deutschland
Pipetten Eppendorf, Deutschland
PCR‐Gerät:
Mastercycler Gradient
Eppendorf, Deutschland
III
Disseration Elektroanalytik und Sensorik Uni Bochum.pdf (PDF, 4.11 MB)
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