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Fragenkatalog Bioanalytics II .pdf



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1

Biocatalytic Assays
1. Formula and graph (both linear and semi-logarithmic with respect
to the X-axis) for the realtive occupancy of an enzyme versus substrate concentration.

Für die lineare Betrachtung der x-Achse:
]
= [kk−1
Km = [E]∗[S]
[ES]
1
[Et ] = [E] + [ES]
Einsetzen:
⇒ Substratbindungskurve: [ES]
= Km[S]
[Et ]
+[S]

1

2. Formula and graph (both linear and semi-logarithmic with respect
to the X-axis) for the velocity of an enzyme versus substrate

(b) Lineweaver & Burk

(a) Michaelis Menten Diagramm

v
v = [ES] ∗ kcat
= [ES]
kcat
In die in 1. verwendete Substratbindungskurve einsetzen:
[Et ]∗[S]
v
= [ES] = K
kcat
m +[S]
vmax = kcat ∗ [Et ]
⇒ v = vmax ∗ Km[E]
= vmax ∗ [ES]
+[S]
[Et ]
Zur Linearisierung dieser Gleichung wird das Lineweaver & Burk Modell
verwendet:
1
1
m]
+ v[Kmax
∗ [S]
⇒ v1 = vmax

3. Compare topic 1 with topic 2. How do the formulae differ? How
do the two graphs differ?
Topic 2 gibt die Beziehung zwischen enzymatischer Verarbeitung(-sgeschwindigkeit)
des Substrates und der Konzentration des Substrates wieder.
Topic 1 bezieht sich hingegen nur auf die Bindungsrate des Enzyms an das
Substrat.
Die Formeln unterscheiden sich eigentlich nicht, da die Formel aus Topic 2
aus der Formel von Topic 1 entsteht und nur eine Erweiterung dieser mit
den oben gezeigten Annahmen ist.
Folglich unterscheiden sich die Graphen bezüglich ihres Verlaufs nicht. Aber
bezüglich der Skalierung der y-Achse. Bei der Linweaver & Burk Darstellung
ist natürlich ein Unterschied feststellbar, da diese die linearisierte Variante
darstellt.
2

4. What is meant by the "velocity"of an enzyme reaction?
Die Geschwindigkeit einer enzymatischen/biochemischen Reaktion wird definiert als Rate mit der das Produkt entsteht (pro Zeit) welche gleich der
Rate an Substratverbrauch ist.
Diese Rate ist proportional zu der Konzentration an Enzym-substrat-Komplexen
[ES], und die Proportionalitätskonstante ist gleich der katalytischen Wechselzahl (catalytic turnover number) kcat .
5. Which kinetic regime of enzyme reaction is used in ELISA or Western Blotting?
Bei ELISA und ähnlichen Methoden ist die Anzahl der an die Oberfläche
gebundenen Marker-Enzyme durch ihre Aktivität, wie bspw. Farbproduktion, erkennbar. Hierfür ist es aber essentiell die Enzyme bei ihrer maximalen
Geschwindigkeit arbeiten zu lassen:
• Dies gibt die höchste Signalintensität
• Bei einer vorgegebenen Temperatur und pH-Wert ist die maximale
Rate an Farbproduktion durch das Enzym reproduzierbar und vorhersagbar, es ist also egal wo oder wann man den Versuch durchführt.
6. Which kinetic regime is used when we quantify an enzyme?
????Frage 5????
7. Describe homogeneous enzyme assays in the photometer? What
do the measured data look like (draw a sketch)? How is the assay
calibrated? Draw a crude sketch of a calibration curve with proper
lables on the X and Y axis.
Substrat und Co-Substrat werden mit einer mindestens 10-fach höheren
Konzentration als der KM -Wert des Enzyms verwendet. Dann wird das
Enzym in so großer Menge hinzugegeben, dass sich die Konzentration des
(Co-)Substrates nur um 10−6 pro Minute verändert. D.h. das nur «1% des
Edukts während der Assaymessung verbraucht wird. Nun wird in definierten
Zeitabständen die Extinktion bei einer festgelegten Wellenlänge gemessen.

3

Die Messergebnisse sollten folgendermaßen aussehen:

Abbildung 3: Gemessene Daten

Die Kalibrierung erfolgt über viele parallel laufende Experimente bei denen
verschiedene bekannte Mengen Enzym zu den Mixturen der Reaktanten
hinzugegeben werden. Die Rate der Enzymreaktion wird über die Bildung
des leuchtenden/gefärbten Produkts gemessen. Die erhaltenen Messwerte
ergeben die Kalibrierkurve:

Abbildung 4: Mögliche Kalibrierkurve

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8. Name chromogenic substrates which are typically used to monitor
enzyme reactions. For which type of enzymes are they used?
pNPP, NBT, Fast Red RC . . . Alkaline Phosphatase
OPD, TMB, DAB . . . Peroxidase
9. Serum contains many different enzymes. How is it possible to selectively quantify one specific enzyme only in a particular type of
assay?
Indem man dem Serum ein Substrat hinzugibt, dass spezifisch für dieses
eine Enzym ist.
Bspw.: NAD+ passt zu allen Dehydrogenasen, Lactat aber wird nur von
Lactathydrogenase umgesetzt. Daraus folgt, wenn eine Lösung nur Lactat
und NAD+ beinhaltet, kann nur LDH einen messbares Feedback geben.
10. How do we quantify a substrate in a homogeneous assay via UV-vis
absorbance? Give one example. What do the measurement data
look like? How is the assay calibrated? Draw a crude sketch of a
calibration curves with proper labels on the X and Y axis
Will man bspw. die Menge an Glucose in einer Probe bestimmen, mischt
man diese mit einem luftgesättigten Puffer der viel Glucoseoxidase, Peroxidase und einen farblosen Precursor enthält.
Glucose + O2 → Gluconolacton + H2 O2
Das entstandene H2 O2 wird nun quantitativ in der nächsten Reaktion vrebraucht, katalysiert von der Peroxidase:
H2 O2 + 2 ABT SH + → H2 O + 2 ABT S +
ABTS+ ist intensiv grün und die Realtion läuft bis alle Glucose verbraucht
ist. die Intensität der grünen Farbe am Ende ist proportional zur Konzentration der Glucose am Anfang.

Abbildung 5: Quantifizierung von Glucose

Kalibrierung siehe Abb. 5

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11. Describe homogeneous enzyme assays in the fluorimeter. Which
enzymes are typically quantified with such an assay? How does
the assay work? How is it calibrated? ? Draw a crude sketch of the
calibration curve
Siehe Frage 7 und 10.

Abbildung 6: Beispiel Enymassay in Fluorimeter

12. Which substrate is used in a homogeneous fluorometric assay for
trypsin? Which substrate is used for matrix metalloproteinase (in
general terms)? Which for pepsin (in general terms)?
Trypsin ist ein Mix aus drei Verdaungsenzymen und gehört zu den Peptidasen genauso wie Pepsin.
→ Substrat ist ein Peptid.
Bei der Matrix-Metalloproteinase ist das Substrat wahrscheinlich ein Protein, dass mit einem Metall eine Matrix bildet.
13. Describe the semi-quantitative estimation of protease activity in a
heterogeneous assay format. Why is this format ideal for parallel
detection of many different proteases in a single sample (e.g. spinal fluid)?
Sobald die mit Markerenzym versehenen Antikörper an das Antigen gebunden haben und die ungebundenen weggewaschen worden sind, wird
das Enzym benutzt um aus einem gelösten Precursor ein farbiges (fluoreszentes) Produkt herzustellen. Quantifiziert wird die Proteaseaktivität nun
durch das Signal des Produkts welches einen Rückschluss auf die Anzahl
der gebundenen Label gibt.
Diese Format ist deswegen so gut um viele verschiedene Proteasen in einer
Probe zu detektieren, da man verschiedene Antikörper mit unterschiedlichen Markerenzymen zugeben kann, welche wiederum jeweils andere Farben zeigen → Jede Farbe zeigt eine andere Protease

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14. Heterogeneous binding assays: Name some examples. How do they
work? ? Describe immunocytochemistry or Western blotting in detail. What is the role of the marker enzyme in this assay? What is
the advantage of a marker enzyme as compared to a fluorescent
label? Which enzyme substrates (generally speaking, no chemical
details) are used for which kind of assay? When must we use a
fluorescent label in place of a marker enzyme?
Beispiele: Cytochemie, Histochemie, Arrays, ELISA
ELISA: Die Analyt-Moleküle sind auf dem Boden der Behälter einer Mikrotiterplatte von "Einfangmolekülen"(Antikörper) festgehalten. Es wird
ein weiterer Antikörper hinzugegeben welcher einen Enzymmarker hat →
Farbiges Produkt entsteht und zeigt an, dass das gesuchte Antigen da ist.
Immuno-PCR: Gleiches Prinzip wie ELISA, allerdings anstatt von Markerenzymen sind hier DNA-Marker an den Antikörpern angeheftet welche
durch PCR vervielfältigt wird und durch SYBR-Grün sichtbar gemacht wird.
Westernblotting: Das Antigen wird auf einer passenden Oberfläche befestigt und die freien Bindungstellen von für die Antikörper unspezifischen
Stoffen blockiert. Die Antikörper werden zugegeben und binden an das
Antigen. Nun wird gewaschen, um alle nicht an ein Antigen gebundenen
Antikörper wegzubekommen. Anschließend wird ein Antikörper für den FcSchwanz des vorherigen Antikörpers hinzugegeben, der mit einem Marker
versehen ist. Dieser Marker lässt bspw. einen fluoreszierendes Produkt entstehen. → Nachweise des Antigens
Der Vorteil einens Markerenzyms ist eine starke Signalintensität gegenüber
eines Fluoreszierenden Labels.
Markerenzyme: Alkaline Phosphatase, Horse radish peroxidase
15. Describe the sandwich ELISA. How is the assay calibrated? ? Draw
a crude sketch of the calibration plot! How high should the substrate concentration be (generally speaking)? How can we check
if it is high enough? Which marker enzymes are typically used in
ELISA?

Abbildung 7: Sandwich-ELISA-Vorgang

Siehe Fragen, 14, 8, 7

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16. Compare Immuno-PCR with ELISA. Which steps are performed in
Immuno-PCR? Which method of PCR is used here? What do the
data look like? How is the assay calibrated? Why is Immuno-PCR
more sensitive than ELISA?
Siehe Frage 14.
PCR-Mehtode: Quantitative PCR (qPCR)
Die Kalibrierung erfolgt durch auftragen der Anzahl der Zyklen die erforderlich sind den Grenzwert zu erreichen gegen die Anzahl an Vorlagensträngen
in einem PCR-Röhrchen:

Abbildung 8: Beispiele Kalibrierkurven qPCR

Immuno-PCR ist sensitiver als ELISA, da man mit qPCR sehr viel mehr
Nachweis-DNA herstellen kann als die Enzyme Fluoreszenz bei ELISA.
17. How can the concentration of glucose in serum be quantified with
a homogeneous enzyme assay? Which enzymes and substrates (cosubstrates) are involved? How high should the concentrations of
these components be (generally speaking)?
Siehe Frage 10.
Die Konzentration der Glucose sollte weit über der der Glucoseoxidase liegen, damit diese mit ihrer maximalen Leistung arbeiten kann, die Lösung
in der die Reaktion geschieht sollte außerdem mit Sauerstoff gesättigt sein.
Generell sollte von allen Komponenten genug vorhanden sein um am Ende
ein auswertbares Ergebnis zu erhalten.

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18. How can the concentration of glucose in blood be measured with
the help of a reflectometric glucose sensor?

Abbildung 9: Reflektorischer Glucosesensor

19. How is uric acid in serum quantified by a homogeneous enzyme
assay? (You need not learn the chemical reaction, just describe
the principle!) How is the assay calibrated?
Die Probe in einer Küvette wird umgerührt und die Absorption bei 290nm
wird gemessen(über die Zeit). Zum Zeitpunkt t=0 wird Urease zugegeben
und ein Abfall der Absorption bei 290nm tritt auf. Die Differenz des Startwertes mit dem Endwert der Absorption bei 290nm ist proportional zur
Konzentration von Harnsäure in der Probe.
Kalibrierung erfolgt über Messungen mit verschiedenen Standards, deren
Konzentration an Harnsäure bekannt ist.

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